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Annexin V-Fluor647/PI 双染细胞凋亡检测试剂盒

Annexin V-Fluor647/PI 双染细胞凋亡检测试剂盒

¥300.00

货号:BL1885A

规格:20T

品牌:Biosharp

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商品详情:

产品简介:

在磷脂酰丝氨酸(PS)是一种带负电荷的磷脂,正常细胞中,PS只分布在细胞膜脂质双层的内侧,而在细胞凋亡早期,细胞膜PS由脂膜内侧翻向细胞膜外侧,使PS暴露在细胞膜外表面。Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力,故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被公认为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。

将Annexin V进行红色荧光Fluor647标记,以标记了的Annexin V作为探针,利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一种核酸染料,它不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜,但对凋亡中晚期的细胞和坏死细胞,PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此采用Annexin V与PI双染的方法,就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

 

产品组分:

产品编号

产品名称

BL1885A

BL1885B

BL1885C

1

Annexin V-Fluor647

100μl

250μl

500μl

2

Propidium Iodide, PI

200μl

500μl

1000μl

3

Binding Buffer (4´)

4ml

10ml

20ml

 

使用方法:

1、细胞样品的准备

悬浮细胞:

(1)收集细胞至离心管中,1000-2000rpm离心5min,小心去除上清。

(2)用1ml 4℃预冷PBS轻轻重悬细胞并计数,1000-2000rpm离心5min,小心吸除上清。

(3)再加入1ml 4℃预冷的PBS重悬细胞,1000-2000rpm离心5min,小心吸除上清

贴壁细胞:

(1)吸出细胞培养液至离心管中,PBS洗涤贴壁细胞一次,加入适量不含EDTA的胰酶细胞消化液消化细胞。

(2)室温孵育至轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时,吸除胰酶细胞消化液。需避免胰酶的过度消化。

(3)加入步骤(1)中收集的细胞培养液,稍混匀,转移到离心管内,1000-2000rpm离心5min,小心吸除上清。

注意:加入步骤1中的细胞培养液一方面可以收集已经悬浮的发生凋亡或坏死的细胞,另一方面细胞培养液中的血清可以有效抑制或中和残留的胰酶;残留的胰酶会消化并降解后续加入的Annexin V-Fluor647导致染色失败。

(4)用1ml 4℃预冷PBS轻轻重悬细胞并计数,1000-2000rpm离心5min,小心吸除上清。

(5)再加入1ml 4℃预冷的PBS重悬细胞,1000-2000rpm离心5min,小心吸除上清

2、用去离子水按1:4稀释Binding Buffer(4ml Binding Buffer+12ml去离子水);

3、用适当体积的结合缓冲液重新悬浮细胞,调节其浓度为1×106/ml;

4、取100μl的细胞悬液于5ml流式管中,加入5μl Annexin V-Fluor647,轻轻混匀;

5、室温(20-25℃)避光孵育10min;

6、上机前5min加入10ml碘化丙啶溶液,轻轻混匀;

7、上机前在反应管中补加400ml PBS重悬细胞,避光保存,随即进行流式细胞仪(FACS)检测,Annexin V-Fluor647和PI均为红色荧光。 

 

图1. 流式细胞仪检测早期凋亡细胞

右下象限为早期凋亡细胞,右上象限为凋亡晚期细胞和坏死细胞。

 

注意事项

1、微量试剂需离心数秒,将试剂收集至管底后再开盖取用。

2、Propidium Iodide(PI)有毒,操作时要带手套,使用时避免与皮肤,眼睛和黏膜接触。

3、Annexin V-Fluor647中含有剧毒成分叠氮化钠(NaN3),操作时要带手套,使用时避免与皮肤,眼睛和黏膜接触。

4、本试剂盒用于检测活细胞,流式细胞仪检测时,细胞数量不应低于1×106

5、染色后宜尽快检测,时间过长可能会导致凋亡或坏死细胞的数量增加。

6、Annixin V检测凋亡细胞的方法适用于悬浮生长的细胞,如:淋巴细胞等细胞的检测。对于贴壁生长的细胞,由于在胰酶等消化处理过程中会造成细胞膜的损伤,会造成较高的假阳性,而用细胞刮刀会造成细胞粘连成团,而影响检测,可将胰酶消化后的细胞保存在含2%BSA的PBS中,防止进一步的损伤。

7、消化贴壁细胞残留的胰酶会消化并降解Annexin V-Fluor647,最终导致染色失败。

8、细胞固定后可能导致荧光的淬灭,请不要固定样品

9、本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

10、为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

 

保存条件:

4℃避光保存,一年有效。

货号 BL1885A
规格 20T
品牌 Biosharp
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