随机突变试剂盒

产品简介：

随机突变是阐述蛋白质结构和功能之间的关系、改进蛋白质性能的重要工具。随机突变试剂盒基于易错PCR（error-prone PCR）技术，利用 Taq DNA polymerase 不具有 3′→5′校对功能的特性，在特定的反应缓冲体系中，向扩增的目的基因中引入随机突变密码子。带有随机突变的扩增产物通过双酶切，连接到表达载体中构建文库，然后转化入表达宿主中，进行蛋白活性筛选。如果经一次突变反应不能获得满意的结果，可采用连续易错 PCR（sequential error-prone PCR）策略，即将一次 PCR 扩增得到的有用突变基因作为下一次 PCR 扩增的模板，连续反复地进行随机诱变，使每一次获得的突变累积而产生更有意义的突变。

本试剂盒2×Random Mutation System组分中含有优化浓度的Taq DNA polymerase、dNTPs、反应缓冲液和稳定剂，可最大限度地克服常规易错 PCR 技术中，由于Taq DNA polymerase本身的偏爱性造成的以 GC 突变为主的缺点，获得相对均衡的突变谱。碱基突变率可通过适量添加Mutation Enhancer、调整模板 DNA 量和改变 PCR 扩增循环数进行控制。

下表列出以 10 ng 质粒 DNA 为模板，PCR 扩增一条 1 kb DNA 片段（20 个循环）后测序检测得到的突变率结果。需要注意的是，由于不同 DNA 模板的碱基组成不同、长度不一，以及不同引物的扩增效率存在差异，所以即使在相同的PCR反应条件下，两组 PCR 产物所得到的突变率也可能不同。因此我们建议根据实验的具体要求，首先进行多个小体系（20μL）扩增预实验，分别加入不同体积的 Mutation Enhancer（如 0 μL、1μL、5 μL、10 μL 等），摸索出符合目标突变率的反应条件后，再放大扩增体系。其他影响突变率的因素见【注意事项】。

以50 μL PCR反应体系为例：

本试剂盒适用于扩增低于 4 kb、GC 含量在 70%以下的目标 DNA 片段。

产品组份：

注意事项：

1. 由于不同 DNA 模板的碱基组成不同、长度不一，以及不同引物的扩增效率存在差异，所以即使在相同的PCR反应条件下，两组 PCR 产物所得到的突变率也可能不同。因此我们建议根据具体实验要求，首先进行多个小体系（20 μL）扩增预实验，分别加入不同体积的 MutationEnhancer（如 0 μL、1 μL、5 μL、10 μL 等），通过测序或活性检测等方法，摸索出符合目标突变率的反应条件后，再放大扩增体系。
2. 起始 DNA 模板的浓度对突变率有很大影响，通常可通过提高或降低 DNA 模板的浓度来调整突变率。鉴于不同型号的分光光度计检测的 DNA 浓度存在偏差，DNA 模板最好在酶切线性化后，采用凝胶电泳方法，与已知浓度的线性化双链DNA或商品化的 DNA marker 进行对比，确定其浓度。
3. 突变反应产物必须进行切胶回收处理，去除 DNA 模板、PCR 产物上结合的 Taq 酶以及其他杂质。常规的乙醇沉淀、硅胶膜（珠）或玻璃奶吸附等方法，均无法去除结合的 Taq 酶，后者可能遮蔽酶切位点，影响克隆效率。
4. 建立随机突变文库通常需要 10-200 ng/μL （相当于 500 ng -10 μg/50 μL 体系）的 PCR 产物。如遇产量不足，可通过下列方法提高产量：

• 突变率符合需求时，可放大 PCR 体系，或切胶回收 PCR 产物后，采用常规 PCR 反应条件进行扩增；
• 突变率低于需求时，提高 PCR 扩增循环数，或切胶回收 PCR 产物后，进行第二轮随机突变反应；
• 重新设计扩增引物;
• 降低退火温度；
• 确保模板质量，采用凝胶电泳方法精确定量。

5. 对于带有克隆酶切位点的 DNA 模板，必须在 PCR 反应结束后，使用 DpnI 完全消化清除甲基化的模板，再切胶回收目标DNA 片段。对于非甲基化的质粒（例如从大肠杆菌 JM110 或 SCS110 菌株中提取的质粒），可通过转化dam＋的大肠杆菌菌株（如 DH5α、TOP10、JM109、XL1-Blue 等），再抽提获得甲基化的质粒作为 PCR 反应模板。
6. 经过双酶切的克隆载体在插入突变 DNA 片段前，应首先通过自身连接检测，确保极低的自连背景。必要时可采用去磷酸化、切胶回收等方法把自连率降至最低，以免影响后续连接反应。
7. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。
8. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

有效期：

-20℃保存，一年有效。经常使用，可于 4℃保存，保质期 3 个月。