快速银染试剂盒 

产品简介：

快速银染试剂盒(Fast Silver Stain Kit)是一种快速简单、可用于SDS-PAGE或非变性PAGE等蛋白银染的试剂盒。本试剂盒也可以用于2D凝胶的银染,并且染色后兼容后续的质谱检测。本试剂盒只需约90分钟内可以完成凝胶的银染。对于BSA蛋白,检测灵敏度可以达到0.3ng蛋白。

本试剂盒可足够用于25块常规的8×10cm凝胶的银染。

   说明书后附有实验记录表格,方便记录实验步骤。

注意事项：

1、由于银染非常灵敏,操作时请注意尽量使用高纯度的水,并确保所使用的器皿非常清洁,最好使用洁净的玻璃器皿。操作时必须戴手套,避免皮肤和凝胶直接接触。

2、需自备乙醇、冰醋酸及MilliQ级纯水或双蒸水。

3、下述使用说明中各种溶液的使用量适用于大小为8×10cm厚度为0.75-1mm的凝胶。对于更大的凝胶,各种溶液的使用量需按凝胶面积的比例放大,对于更厚的凝胶,作用时间需按照厚度的比例适当延长。

4、本说明书所指的常温温为20-25℃,操作温度较低时由于溶液的扩散能力下降,各步骤需适当延长时间。

5、银染基本显色液(10×)在低温环境下可能会出现沉淀,可在30-37℃水浴中溶解,并充分混匀后使用。

6、为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法：

一. 固定步骤：

1、电泳结束后,取凝胶放入约100ml固定液中,在摇床上室温摇动20分钟,摇动速度为60-70rpm。固定40分钟以上甚至过夜可以进一步降低背景。

固定液的配制：

2、 30%乙醇洗涤：

弃固定液,加入100ml 30%乙醇,在摇床上室温摇动10分钟,摇动速度为60-70rpm。  

30%乙醇的配制：

70ml MilliQ级纯水或双蒸水中加入30ml乙醇,混匀后即成100ml 30%乙醇。

3、水漂洗：

弃30%乙醇,加入200ml MilliQ级纯水或双蒸水,在摇床上室温摇动10分钟,摇动速度为60-70rpm。

二. 增敏步骤：

1、弃水,加入100ml银染增敏液(1×),在摇床上室温摇动2分钟,摇动速度为60-70rpm。

银染增敏液(1×)的配制：

99 ml MilliQ级纯水或双蒸水中加入1ml银染增敏液(100×),混匀后即为银染增敏液(1X)。银染增敏液(1×)配制后需在2小时内使用。

2、水漂洗(共2次)：

弃原有溶液,加入200ml MilliQ级纯水或双蒸水,在摇床上室温摇动1分钟,摇动速度为60-70rpm。 重复此步骤一次。

三. 银染步骤：

1. 弃水,加入100ml银溶液(1×),在摇床上室温摇动10分钟,摇动速度为60-70rpm。

银溶液(1X)的配制：

99ml MilliQ级纯水或双蒸水中加入1ml银溶液(100X),混匀后即为银溶液(1X)。银溶液(1X)配制后需在2小时内使用。

2、水洗涤：

弃原有溶液,加入100ml MilliQ级纯水或双蒸水,在摇床上室温摇动1-1.5分钟,摇动速度为60-70rpm。

注意：水洗涤的时间不能超过1.5分钟。

四. 显色步骤：

弃水,加入100ml银染显色液,在摇床上室温摇动3-7分钟,直至出现比较理想的预期蛋白条带,摇动速度为60-70rpm。 

五.  终止步骤：

1、弃银染显色液,加入100ml银染终止液(1×),在摇床上室温摇动10分钟,摇动速度为60-70rpm。终止时有气体产生属正常现象,产生的气体为二氧化碳。

银染终止液(1×)的配制：

95ml MilliQ级纯水或双蒸水中加入5ml银染终止液(20×),混匀后即为银染终止液(1X)。银染终止液(1X)配制后宜当天使用。

2、水洗涤：

弃银染终止液,加入100ml MilliQ级纯水或双蒸水,在摇床上室温摇动5分钟,摇动速度为60-70rpm。  

六. 保存：

可在MilliQ级纯水或双蒸水中保存。或采用适当的方式制备成干胶。

常见问题：

1、 背景太深：

（1）显色时间过长。通常显色反应会在10分钟内结束,显色反应时间过长会导致背

景很深。

（2）洗涤不充分。洗涤时间过短,或洗涤液加入的量不足,或者容器过于狭小导致摇动时溶液不易充分混合,或摇动速度过慢,导致混匀不充分。请按照说明书的建议确保各种溶液的用量和作用时间,摇床的推荐速度为60-70rpm。

（3）凝胶中原有的缓冲液等未在固定步骤中去除干净。一方面需确保固定的时间和固定液的用量,另一方面对于不是最常用的Bis-Tris缓冲的凝胶需要更长的固定时间以充分去除凝胶中的原有缓冲成分,以降低背景。

（4）水的纯度太低。需使用大于16 MΩ·cm的高纯度水。

2、 蛋白条带非常浅：

（1）蛋白的半胱氨酸(Cysteine)残基的含量特别低或几乎没有。半胱氨酸残基的存在对于银染非常重要,半胱氨酸残基的含量过低会导致检测灵敏度下降。

（2）银染后水洗涤时间过长。在银溶液染色时需严格控制水洗涤的时间,水洗涤的时间不能超过1.5分钟,否则会导致过多的银离子被洗去,导致检测灵敏度下降。

（3）样量不足。本试剂盒检测BSA的灵敏度可以达到0.3ng,对于不同的蛋白检测灵敏度可能不同。对于一些蛋白可能需要大于1ng的蛋白量才能被检测到。

（4）固定步骤后的洗涤不够充分。导致少量乙酸残留,影响后续检测。确保30%乙醇洗涤和水洗涤的用量和时间,可以适当延长洗涤时间。

3、凝胶上出现小点或其它非蛋白的痕迹：

（1）凝胶没有充分被溶液浸没。请注意选择大小合适的容器,并加入足量的各种溶液,同时需保持适当的混匀速度确保凝胶可以被溶液浸没。

（2）用于银染的容器没有充分洗涤干净。容器需先用洗涤剂充分洗涤,随后用自来水充分冲洗,最后用高纯度水再洗涤数次。该容器最好能专用于银染,并注意避免各种可能的蛋白污染。为确保充分洗涤干净,对于耐硝酸的容器,例如玻璃容器,可以在上述洗涤剂及自来水洗涤后用50%硝酸洗涤,随后用高纯度水充分洗涤。

（3）指纹或其它压痕。请注意戴手套操作,切勿直接接触皮肤。操作时请注意尽量勿挤压、折叠或摩擦凝胶。

（4）有金属物质接触凝胶。金属物质例如金属镊子等接触凝胶会出现非特异性痕迹。

4、在60-70 kD处出现一片模糊的蛋白染色背景：

皮肤上脱落的角蛋白(keratin)污染了蛋白样品。一方面需注意戴手套操作,另一方面需注意盛放蛋白样品的容器盖子尽量不要敞开,甚至在取放蛋白样品时在超净台内进行以避免可能的角蛋白污染。

5、在凝胶的顶端处出现黄色背景：

（1）样品中DTT浓度很高。采用其它适当的还原试剂,或者在许可范围内适当减少DTT的用量。 

（2）采用Tris-Glycine-SDS电泳体系。Tris-Glycine-SDS电泳体系中的Glycine会导致背景凝胶的顶端出现轻微的黄色背景。

6、银在染色器皿中出现沉淀：

染色器皿中可能含有残余的洗涤剂或上次银染时的残余试剂。需确保把染色器皿洗涤干净。

保存条件：

BL620A-3 4℃保存，其他组分常温保存，开封后一年有效。