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荧光定量PCR试剂盒(SYBR Green Master Mix)

品牌:biosharp

编号:BL705A

名称:荧光定量PCR试剂盒(SYBR Green Master Mix)

规格:5X1ml

价格:950.00

说明书:

SYBR Green Master Mix

荧光定量PCR试剂盒(SYBR Green)


产品编号

产品名称

规格

BL705A

荧光定量PCR试剂盒(SYBR Green)

5X1mL

 

别名:SYBR Green荧光定量PCR预混液

产品简介:

本产品是使用SYBR® Green I嵌合荧光法进行qPCR反应的专用预混液。核心组分为一种新型的抗体法热启动DNA聚合酶,具有特异性强、检测灵敏度高等诸多优点,配以针对qPCR优化的最适Buffer,非常适合于进行高特异性、高灵敏度的qPCR反应。本产品是一种含有qPCR反应最适浓度SYBR® Green I的2×预混液,可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线,对靶基因定量准确、重复性好、可信度高。同时,优化的预混液可缩短Real-Time PCR的反应时间,适用于标准或快速PCR仪。

 

产品组分:

产品编号

产品名称

规格

1

2×qPCR MasterMix (SYBR Green)

5×1mL

2

50×ROX Reference Dye

1ml

3

RNase-Free ddH2O

5ml

 

保存条件:

收到本产品后, 请立即置于-20 ℃ 避光保存。从-20 ℃ 取出使用时, 将冻存的qPCR MasterMix和ROX Reference Dye融解,然后轻轻颠倒混匀,待溶液完全均一后再行使用。如解冻后没有使用,须彻底混匀后重新冷冻。(在解冻过程中盐会出现分层现象,如未混匀进行冷冻,盐晶体的析出将会对酶造成损害)。如需一段时间内经常取用,可在2~8℃条件下储存3个月。避免反复多次冻融。

 

使用说明:

一、配制 Real-Time PCR反应体系:

1. 将所有试剂qPCR MasterMix,ROX Reference Dye,模板,引物和RNase-Free ddH2O,在室温下溶解并彻底混匀。

2. 建议置于冰上进行Real-Time PCR反应液的配制。


参考下表配制反应体系:

组分

20ul体系

25ul体系

50ul体系

终浓度

qPCR MasterMix

10μl

12.5 μl

25 μl

正向引物(10 μM)

0.6 μl

0.75 μl

1.5 μl

300 nM*

反向引物(10 μM)

0.6 μl

0.75 μl

1.5 μl

300 nM*

cDNA模板

--

ROX Reference Dye

RNase-Free ddH2O

至20 μl

至25 μl

至50 μl

* 一般来说反应体系中引物终浓度为300 nM即可得到较好的扩增效果。当反应性能比较差时,可以在终浓度200-500 nM范围内调整引物浓度。

* 几种常见仪器的最适ROX Reference Dye浓度见下表:

仪器型号

使用浓度

ABI PRISM 7000/7300/7700/7900HT/StepOne等

ABI 7500、7500 Fast;

Stratagene Mx3000P、Mx3005P和Mx4000等

Roche,Bio-Rad,Eppendorf等品牌仪器

无需添加 


2、盖上反应管,轻柔混匀。可瞬时离心,确保所有样品均在管底。


二、进行Real-Time PCR反应

建议采用两步法PCR反应程序进行反应。

若模板量较低等因素导致扩增效果不佳,可使用三步法程序进行PCR反应。


两步法反应程序:

步骤

温度

持续时间

循环数

预变性

95℃

1min

1

变性

95℃

5sec

40

退火延伸数据采集

60℃

15sec

40

溶解曲线分析

根据仪器推荐程序设置

 

三步法反应程序:

步骤

温度

持续时间

循环数

预变性

95℃

1min

1

变性

95℃

5sec

40

退火

50-60℃

10sec

40

延伸数据采集

72℃

15sec

40

溶解曲线分析

根据仪器推荐程序设置

* 请先使用60℃ 15 sec进行扩增。如果需要进一步优化,可以尝试在56-66℃ 范围内进行。

* 使用不同型号仪器进行时间设定时,请按照仪器使用说明书要求进行实验操作,几种常见仪器的时间设定见下表:

使用ABI7500时请设定在32 sec。

使用ABI 7000和7300时请设定在31 sec。

使用ABI 7700/7900HT/7500 Fast,Roche,BioRad和Agilent等公司荧光定量PCR仪时请设定在15sec。

* 通常引物退火温度比引物的解链温度(Tm)低5℃,如果引物碱基数较少,可以适当提高退火温度,这样可以使PCR的特异性增加;如果碱基数较多,那么可以适当减低退火温度。

 

常见问题


1、无扩增信号或扩增曲线起峰晚或仅有引物二聚体

原因

解决办法

DNA模板中存在抑制剂

重新纯化模板或降低模板使用量

Mg2+浓度不合适

使用qPCR MasterMix时,PCR反应体系中Mg2+的终浓度为2 mM。对有些扩增体系,可以将Mg2+终浓度提高到5 mM。进行Mg2+终浓度优化时,建议每次增加0.5   mM Mg2+浓度进行实验。

PCR 条件、引物序列或浓度不当

请确认引物未发生降解,引物浓度及PCR 条件,扩增不好时,通常先尝试降低退火温度,延长退火时间和提高引物浓度,有时也可以提高退火温度,增加延伸时间,降低升温速度。对于GC   含量高的模板,可以适当延长变性时间。如果还是扩增不好,请重新设计引物。

起始模板问题

检查起始模板的浓度,保存条件和质量。重新对模板进行线性梯度稀释,并用新稀释模板进行实验。增加起始模板使用量。

加样错误或试剂问题

检查试剂浓度和保存条件,包括所使用的引物和模板。重复进行实验。


 2、NTC出现较高的荧光值

原因

解决办法

试剂污染

建议使用新试剂进行实验。

PCR反应液配制时发生污染

采取必要的防污染策略(如使用带滤芯的枪头)。

引物出现降解

可以使用变性聚丙烯酰胺胶检测引物降解情况 


3、出现引物二聚体和(或)非特异扩增

原因

解决办法

Mg2+浓度不合适

使用qPCR MasterMix的反应体系含有Mg2+的终浓度为2 mM。对有些扩增体系,可以将Mg2+终浓度增加到5 mM。 建议每次增加0.5 mM Mg2+浓度进行优化。

PCR退火温度太低

建议每次增加2℃进行退火温度优化。

引物设计不合适

考虑重新设计引物序列。

PCR产物太长

荧光定量PCR产物长度最好在100-150 bp之间,而且不应该超过500 bp。

引物出现降解

可以使用变性聚丙烯酰胺胶检测引物降解情况。

计量误差

反应体积太小会导致检测精度下降。请根据定量PCR仪推荐的反应体积重新实验。


4、定量值重现性差

原因

解决办法

仪器方面的故障

因为仪器的不适用,在温度管理或检测时产生重现性差。请根据相应仪器的说明书进行点检。

样品纯度不好

不纯的样品会导致实验的重现性差。

稀释的模板放置太久

通过梯度稀释的模板最好现配现用。

引物质量下降

尽量避免新合成引物批次间的差异,可以使用原来质量好的引物做为对照。

PCR 反应条件、引物浓度、序列等不恰当

扩增效率差的PCR 较容易产生重现性差。通过变更引物的浓度或PCR   反应条件来进行调整。扩增不好时,一般可降低退火温度或提高引物浓度,也可以延长延伸时间。如模板的GC   含量较高,可延长变性时间。仍得不到改善时,建议重新设计引物。

计量误差

反应体积太小会导检测精度下降。请根据定量PCR仪推荐的反应体积重新实验。


注意事项:


1、本产品中含有荧光染料SYBR Green I,保存本产品或配制PCR反应液时应避免强光照射。

2、如果试剂没有混匀,其反应性能会有所下降。使用时请上下颠倒轻轻混匀,请不要使用振荡器进行混匀,尽量避免出现泡沫,并经瞬时离心后使用。

3、引物纯度对反应特异性影响很大,建议使用PAGE级别以上纯化的引物。

4、引物终浓度为0.3 μM可以在大多数体系中获得良好的扩增结果。如果需要进一步优化,可以在 0.2-0.5 μM范围内调整引物浓度。

5、20 μl反应体系中,cDNA模板的使用量一般小于100 ng,基因组DNA模板量一般小于50 ng,逆转录产物作为模板时,使用量应不超过PCR体系终体积的20%。

6、为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。


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